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质谱联用法检测内源性生物标志物的方法

导读:液相色谱-质谱联用法检测内源性生物标志物的方法及样品前处理方法研究进展。


返回列表 来源:未知 发布日期:2019-05-19 13:09【
生物标志物是指能被客观测定及评估的,包括正常生理进程、致病过程及介入治疗后药理学响应的特征性指标,如脉搏、体温、血压、内源性化合物等。其中内源性化合物可以是小分子化合物( 如部分有机酸、激素等) ,也可以是大分子化合物( 如 DNA/RNA、蛋白质等) 。这类化合物在基础环境中以特定的浓度存在,当有干扰时,其浓度水平可能发生改变。它们可能是涉及信号通路、酶促反应链( 如代谢途径) 的某些物质。
 
通常情况下,生物标志物在体内的浓度是其形成和消除达到动态平衡时的结果。通过对某些内源性生物标志物的测定,可获知机体当前所处的生理学状态,这对于某些相关疾病的诊断、预防及治疗过程具有监控与辅助等作用。目前,寻找及发现有价值的生物标志物已经成为生物学研究的重要热点之一。基质效应是由与分析物共流出的其他内源性物质( 例如盐类、胺类、脂肪酸、甘油酸酯等) 造成的影响或干扰。这些物质与分析物共流出至喷雾针可能会影响待分析物的雾化、挥发、裂分、化学反应及带电过程,导致进入质谱的离子减少( 离子抑制) 或增多( 离子增强) ,从而影响定量结果的可靠性和准确性。现
阶段 LC - MS /MS 法定量测定内源性物质存在两大难点,一方面由于未知量的内源性物质已在基质中存在,导致了定量过程中空白基质难以获取; 另一方面,由于 一 些 内 源 性 物 质 含 量 极 低,有 些 甚 至 低 于LC - MS方法的定量下限。为解决这两方面难题,科学家们作出很多努力。

近年来检测生物样品内源性成分的定量方法,包括背景差减法、标准加入法、替代基质法及替代待测物法,同时对含量较低的内源性成分进行测定时所用的化学衍生化-LC - MS 法进行介绍,并通过研究实例加以阐述,以期为 LC - MS /MS 法检测内源性成分提供参考。
 
1 内源性成分测定的方法
内源性成分物质检测中存在的最常见的难点是基质效应的考察,目前较常使用的方法主要有背景差减法、标准加入法、替代基质法及替代待测物法。
 
1. 1 背景差减法 背景差减法
是指从所添加标准品的浓度中减去基质中分析物的内源性背景浓度,随后使用相减的浓度来建立标准曲线。该方法中,分析物及标准曲线具有相同的基质,因此两者具有相同的回收率及基质效应。但为保证方法的重复性,在基质中添加已知浓度标准品后引起峰面积增大的幅度比未添加前的峰面积应满足方法中对重复性的限度要求( 如 15% ~ 20% ) 。因此,方法的定量下限( LLOQ)是由用于绘制标准曲线所用批次基质中的内源性分析物浓度决定的,有别于传统意义上的 LLOQ 是由MS 信噪比为 10 时的浓度。但在实际运用中,若方法所需的 LLOQ 比基质中内源性分析物的浓度要低,可在加入标准品之前对基质进行稀释,而后加入较低浓度的对照品进行实验。但如此操作后就意味着待测样品与绘制标准曲线的基质存在差异,所以需要对基质稀释前后的提取回收率进行考察对比。另一方面,加入基质的标准品浓度较低时,可能会引起样品的不稳定。当加入的 2 - 花生基甘
油醚及血栓素 B2 质控( QC) 样品的浓度为 1. 3 ng /ml时,日内变异系数( CV) >40%,当加入浓度为 20 ng /ml时 CV 均 <20%。
 
1. 2 标准加入法 标准加入法的应用主要分为两类: 一类是制备不含分析物的空白基质,前提是基质中所含分析物的浓度非常低( 一般在 LLOQ 的 20% 以下) ,也可通过某些方式( 如活性炭吸附等) 使得空白基质内的分析物浓度达到预设要求。另一类是在相同基质中加入分析物从而计算出内源性化合物的浓
度。

1. 3 替代分析物法替代分析物研究中,由稳定同位素标记物作为分析物替代物参与标准曲线的建立及定量的过程。因该方法的基质中缺少内源性成分的干扰,故可对替代分析物进行直接且灵敏的定量。另外,同位素标记物与分析物除分子量有差异外,假定其余理化性质均类似,因此它们具有相同或者类
似的提取回收率、色谱保留行为及信号响应。但是实际研究中发现,同位素对照品与未标记分析物通常在保留时间及 MS 灵敏度方面略有差异。因此在实验前,必须对标记物及未标记物的 MS 信号响应比值进行测定,其值需在整个校正范围内接近一致。若 RF 不为常数,则需在校正曲线的回归方程中进行体现。
 
2 小 结
内源性生物标志物在现代医疗中担负着越来越重要的角色,故对其检测方法的研究也逐渐凸显出份量,内源性生物标志物的成功定量将对“精准医疗”的发展产生积极的促进作用。采用合适的样品前处理方法及合适的测定方法对方法学的建立及良好的验证产生具有重大意义。但本文所述方法均为非直接测定内源性物质含量的方法,故必须对这类方法进行较为系统的验证。由于目前暂时未有公认、详尽的验证标准和原则,故亟待通过科学家的共同努力,促进该研究方向的发展。